プライマーのデザイン

微量のmRNAを増幅して検出するためにPCRを行います。そのためには、増幅したいmRNAの配列をデータベースから入手して増幅場所を決め、プライマーをデザインせなばなりません。ネット上にPrimer3というデザインサイトがあるのですが、これでデザインしても教科書に書いてあるようなプライマーになりません（泣）。

教科書的にはGC含量が45〜60％でTmが60〜70℃だっけ？
さらに、セルフダイマー、ヘアピン、プライマーダイマーにも気をつけて、3'側にはGかCを持って来て...

で、結局、塩基配列をぼ〜っと眺めてココだと言う場所を探す（笑）。GCリッチな場所の方がTmが上がって良いのですが、ダイマーできまくったりして...

これが1セットならまだしも、同時に2, 3のmRNAを増幅しようとすると、Tmを合わせないと反応がうまく行かないし...

みんな簡単そうにデザインしているのですが、私は半日以上悩んでいた。一応できたけど、実際にPCRしてみないとホントのところは良くわかりません。

でも、うちのラボ（というより部門）と試薬屋さんが大口？契約していて、プライマーが安い。20塩基で10ユーロぐらい？
これならしくじっても...（ってしくじれませんが....）