2004/10/08

WB

昨日から仕込んでおいた(ブロッキング)WBを冷蔵庫から取り出して、一次抗体、二次抗体と反応させ、アマシャムのECLで検出。暗室でX線フィルムを感光させて自動現像装置で現像し、一丁上がり、のハズが....

PVDFメンブレンを二分割して別々の抗体で処理したのですが、1分間感光させても片方が真っ白(何も検出されていません)。あれれ、何かしくじった?
でも、ココで捨ててしまうと貴重なサンプルがもったいないし、転んだらタダで起きるなが日本の恩師の教えなので、無い知恵を絞ります。

前回に同条件で1分間で十分バンドが得られているから、可能性としては一次抗体の力価が落ちたか?
実はこの抗体、自家製なのでちょっとケチって使っています。本来は凍結融解を最小限にして使用するのですが、すでに数回凍結融解を繰り返した代物。だからかなぁ....

も一つは思い当たる節は、一次抗体反応中の温度。室温で1時間反応させるのですが、今日は寒かった。まだ、ラボにはヒーターが入っておらず、15℃ぐらいでした(朝一番)。

メンブレンへの転写はうまく行っているのは確認済み。別の抗体は上手く反応しているので、温度と言うよりは力価?
ならばちょっと長めに反応させましょうということで、再度一次抗体反応から繰り返し(それも朝に使用したものを再利用)。今度は、ちゃんと検出されるべきタンパクが出ました。めでたしめでたし。

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